Resumo
Introdução
Caracterizamos a inervação dérmica em pacientes com síndrome da fibromialgia (SFM) como potencial contribuição para a patologia das pequenas fibras.
Métodos
Biópsias de pele do bezerro foram coletadas (86 pacientes com SFM, 35 controles saudáveis). A pele foi imunorreagida com anticorpos contra o produto gênico da proteína 9.5, peptídeo relacionado ao gene da calcitonina, substância P, CD31 e neurofilamento 200 para pequenos subtipos de fibras. Foram avaliados dois cortes de pele por paciente; em cada seção da pele, duas áreas dérmicas (150 x 700 μm cada) foram investigadas quanto ao comprimento da fibra nervosa dérmica (DNFL).
Resultados
Em pacientes com SFM, encontramos DNFL reduzido de fibras com contato com os vasos em comparação com controles saudáveis (p <0,05). Não houve diferenças para os outros subtipos de fibras nervosas.
Discussão
Encontramos menos fibras nervosas dérmicas em contato com vasos sanguíneos em pacientes com SFM do que nos controles. A relevância fisiopatológica desse achado não é clara, mas sugerimos a possibilidade de uma relação com tolerância térmica prejudicada, comumente relatada por pacientes com SFM.
Citação: Evdokimov D, Dinkel P, Frank J, Sommer C, Üçeyler N (2020) Caracterização da inervação cutânea dérmica na síndrome da fibromialgia. PLoS ONE 15 (1): e0227674. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227674
Editor: Rayaz A. Malik, Weill Cornell Medicine-Qatar, QATAR
Recebido: 2 de novembro de 2019; Aceito: 24 de dezembro de 2019; Publicado: 13 de janeiro de 2020
Direitos autorais: © 2020 Evdokimov et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Creative Commons Attribution License, que permite uso, distribuição e reprodução irrestritos em qualquer meio, desde que o autor e a fonte originais sejam creditados.
Disponibilidade dos dados: todos os dados relevantes estão no manuscrito e em seus arquivos de informações de suporte.
Financiamento: O estudo foi apoiado por uma concessão irrestrita da Else Kröner-Fresenius-Stiftung (N.Ü .: 2014_A129). N.Ü. foi apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG: UE171-5 / 1). Esta publicação foi apoiada pelo Fundo de Publicação de Acesso Aberto da Universidade de Wuerzburg. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta e análise de dados, decisão de publicação ou preparação do manuscrito.
Interesses concorrentes: Os autores declararam que não existem interesses concorrentes.
Introdução
Uma redução da densidade da fibra nervosa intra-epidérmica (IENFD) é um dos achados comumente relatados [1–4], enquanto a inervação dérmica aparentemente não difere dos controles saudáveis [4].
A maioria dos pesquisadores usa anticorpos para o produto gênico da proteína marcadora pan-axonal 9.5 (PGP9.5) para determinar a inervação da pele [5,6]. No entanto, as fibras nervosas dérmicas e epidérmicas compreendem diversas subpopulações, que podem ser diferenciadas por marcadores específicos de proteínas de superfície, p. peptidérgico e não peptidérgico [7], e que diferem em função. Os dados sobre subpopulações de fibras nervosas cutâneas são escassos. Além disso, é uma questão em aberto, como uma redução no número de nociceptores periféricos pode estar associada a mais dor. Embora não tenhamos encontrado diferença na inervação dérmica usando anticorpos para PGP9.5 [4], a composição das fibras dérmicas, algumas das quais dão origem a terminações epidérmicas, pode ser diferente. Embora esses dados não estejam disponíveis para a derme, na epiderme, uma diminuição das fibras nervosas não peptidérgicas e um aumento das fibras nervosas peptidérgicas foram demonstrados em ratos após lesão dolorosa do nervo periférico [8,9]. Em outro estudo, a lesão de constrição crônica do nervo ciático resultou em desnervação epidérmica da pele do rato no momento do comportamento máximo da dor, incluindo fibras imunorreativas ao peptídeo relacionado ao gene da calcitonina [10]. Portanto, investigamos a composição das fibras nervosas dérmicas de pacientes com fibromialgia em comparação com controles saudáveis como potencial contribuinte para pequenas patologias de fibras na SFM.
Métodos
Recrutamento de sujeitos e avaliação clínica
Entre setembro de 2014 e março de 2017, recrutamos 86 mulheres com SFM (idade mediana 51, faixa 23-74 anos), que também faziam parte de um grande estudo clínico [11]. Os critérios de inclusão foram idade ≥ 18 anos e diagnóstico de SFM de acordo com os critérios atuais [12–14]. Os critérios de exclusão foram polineuropatia, dor de outra origem e indistinguível da SFM, diabetes mellitus, disfunção tireoidiana não tratada, insuficiência renal, distúrbios reumáticos diagnosticados por um reumatologista, medicação neurotóxica e abuso de álcool ou substâncias. Todos os pacientes foram vistos individualmente, entrevistados e cuidadosamente examinados por um neurologista. A distribuição da dor foi determinada por entrevista. Estudos de condução nervosa dos nervos sural e tibial foram realizados seguindo procedimentos padrão [15] para excluir polineuropatia. Testes laboratoriais (incluindo hemograma, eletrólitos, função renal e hepática, hormônio estimulador da tireóide, vitamina B12, HbA1c, teste oral de tolerância à glicose) foram realizados para excluir causas alternativas de pequenos danos às fibras.
Além disso, recrutamos 35 mulheres saudáveis como sujeitos de controle (mediana de idade 49, intervalo 22-66 anos) para biópsias de pele (veja abaixo). Os controles eram principalmente conhecidos ou amigos dos pacientes. Os critérios de inclusão para controles saudáveis foram: sem doenças neurológicas, sem dor ou sintomas de neuropatia (ou seja, distúrbios sensoriais, persis), sem doenças metabólicas ou psiquiátricas, exame neurológico normal, neurografias normais do nervo sural e tibial. Todos os participantes do estudo assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido antes da inclusão no estudo. Nosso estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Würzburg.
Biópsia com punção cutânea
Biópsias de punção cutânea de seis mm foram obtidas na panturrilha lateral lateral (10 cm acima do tornozelo), conforme descrito anteriormente [16]. As amostras de pele foram incubadas em paraformaldeído a 4% (PFA; pH 7,4; 2 h) antes do processamento para quantificação de fibras nervosas em criosseções de 40 μm.
Imuno-histoquímica
Para visualizar as fibras nervosas intraepidérmicas e dérmicas, imunorreagimos as seções da pele com anticorpos contra PGP9.5 (516-3344; 1: 1000, Zytomed, Berlim, Alemanha) visualizados por um anticorpo secundário acoplado ao Cy3 (109-165-043; 1: 100, Dianova, Hamburgo, Alemanha). Para subclassificar ainda mais as fibras nervosas, aplicamos anticorpos contra o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP, ab81887, 1: 100, abcam, Cambridge, Reino Unido) e substância P (SP, ab14184, 1: 500, abcam, Cambridge, Reino Unido) como marcadores para fibras peptidérgicas, o neurofilamento 200 (NF200, F-1005, 1: 200, Aves, Tigard, Oregon, EUA) como marcador de fibras mielinizadas e CD31 (550389, 1: 500, BD Pharmingen, San Diego, Califórnia) , EUA) como marcador de células endoteliais. Foi utilizado um anticorpo secundário acoplado ao Alexa Fluor 488 (DDXCH 03A488-100; 1: 100, Dendritics, Lyon, França). Exceto pelo PGP9.5, nenhum dos anticorpos testados apresentou uma marcação imunológica confiável das fibras nervosas epidérmicas em extensas experiências piloto. As seções foram visualizadas usando um microscópio de fluorescência (Axiophot 2, Zeiss, Oberkochen, Alemanha) equipado com uma câmera Axiocam mrm (Zeiss, Oberkochen, Alemanha) e o software SPOT, Windows versão 4.5 (Diagnostic Instruments, Inc, Sterming Heights, Michigan, EUA) .
Quantificação de IENFD
Para determinar o IENFD, três seções de pele por local de biópsia foram avaliadas por um investigador que desconhecia a alocação de indivíduos [17]. Os dados foram comparados com nossos valores normativos de laboratório com base em 106 mulheres saudáveis (idade mediana: 50 anos, intervalo: 20-84). O valor de corte para o IENFD na perna foi estabelecido em <6 fibras / mm.
Quantificação da inervação dérmica
Para quantificação do comprimento da fibra nervosa dérmica (DNFL), usamos um método publicado com pequenas modificações [18]. Foram avaliadas duas seções de pele por sujeito e em cada seção duas áreas dérmicas medindo 150 μm de profundidade x 700 μm de comprimento (S1 Fig), ou seja, quatro áreas dérmicas por sujeito. Como mostrado anteriormente [18], DNFL / mm epiderme e DNFL / mm2 correspondem muito bem e podem ser usados igualmente para quantificação da inervação dérmica. Cada fibra do nervo dérmico na área correspondente foi rastreada manualmente com ampliação de 40x e o DNFL total foi dividido pelo comprimento da epiderme da respectiva área medida (ou seja, 700 μm). Por este meio, medimos todo o comprimento do nervo que mostrava proximidade com um vaso sanguíneo em alguns pontos. Para imunorreações duplas, a sobreposição com PGP9.5 foi verificada em cada fibra nervosa quanto à precisão. No caso do CD31, que é abundantemente expresso na superfície das células endoteliais dos vasos sanguíneos [19], avaliamos as fibras nervosas que entram em contato com os vasos sanguíneos, ou seja, uma fibra nervosa foi categorizada como contato com um vaso sanguíneo, se um contato foi visto no CD31 Manchas duplas PGP9.5. O comprimento dos vasos sanguíneos dérmicos foi determinado conforme descrito para DNFL acima. A quantificação das fibras nervosas dérmicas foi realizada de maneira cega quanto à alocação do grupo de sujeitos.
Análise estatística
O teste de Kolmogorov-Smirnov mostrou distribuição normal dos dados de inervação dérmica. As médias foram comparadas pelo teste t de Student bicaudal não pareado; os dados são apresentados como média +/- desvio padrão. Dados não normalmente distribuídos (IENFD, fibras com contato com o vaso e fibras positivas para SP) foram analisados pelo teste U de Mann-Whitney. Para análise de correlação entre DNFL e IENFD; o teste do coeficiente de correlação de Spearman foi calculado. Para comparação entre os dados categóricos foi utilizado o teste Chi2. Os dados quantitativos são ilustrados como gráficos de caixas indicando a mediana (linha horizontal preta na caixa) e os quartis 25 e 75 (bigodes da caixa). Valores de p <0,05 foram considerados significativos.
Resultados
Dados clínicos
Exame neurológico, estudos de condução nervosa e exames de sangue de rotina foram normais em todos os pacientes. Nenhum de nossos pacientes relatou sintomas ou apresentava sinais clínicos de polineuropatia ou radiculopatia. Pacientes e controles com SFM não diferiram em idade (p> 0,05). Para uma visão geral dos dados clínicos, consulte a Tabela 1.
(consulte no texto original imagens e tabelas)
Inervação da pele
A IENFD foi reduzida em 38/86 (44%) pacientes, enquanto apenas em 7/35 (20%) controles saudáveis (Chi2 p <0,001). O DNFL geral imunorreagido com PGP9.5 não diferiu entre pacientes com SFM (mediana de 0,78 μm / μm de epiderme, variação de 0,38 a 1,18) e controles saudáveis (mediana de 0,85 μm / μm de epiderme; faixa de 0,5 a 1,19 μm / μm de epiderme; faixa de 0,5 a 1,19 μm / μm de epiderme; intervalo de 0,5 a 1,19; ns; Fig 1A), e também não entre pacientes com SFM com IENFD distal normal e reduzida. No entanto, o comprimento total das fibras nervosas dérmicas com contato com os vasos sanguíneos foi menor na pele de pacientes com SFM (mediana de 0,043 μm / μm de epiderme, variação de 0 a 0,33) em comparação com controles saudáveis (mediana de 0,089 μm / μm de epiderme, faixa de 0 a 0,28 , p <0,05; Fig 1B). Como o comprimento médio dos vasos não diferiu entre os grupos (SFM: epiderme de 0,48 μm / μm, faixa de 0,06 a 1,23; controles: epiderme de 0,55 μm / μm, faixa de 0,07 a 1,11; Fig 1C), os achados para a inervação dos vasos foram independentes (Fig. 2) .
Fig 1. Quantificação do comprimento das fibras nervosas dérmicas (DNFL) e das fibras nervosas dérmicas com contato com os vasos.
a: O DNFL não diferiu entre pacientes com SFM e controles saudáveis. b: O comprimento das fibras nervosas dérmicas com o contato dos vasos foi reduzido em pacientes com SFM em comparação com controles saudáveis (p <0,05). c: O comprimento dos vasos sanguíneos dérmicos não diferiu entre pacientes e controles com SFM. Abreviações: DNFL: comprimento da fibra do nervo dérmico; SFM: síndrome da fibromialgia.
(consulte no texto original imagens e tabelas)
Fig 2. Fibras do nervo dérmico em contato com os vasos sanguíneos em um paciente com SFM e um controle saudável.
As fotomicrografias ilustram as fibras nervosas dérmicas em relação aos vasos sanguíneos em um indivíduo controle saudável (a) e um número reduzido de fibras nervosas em contato com os vasos dérmicos em um paciente com SFM (b). As seções da pele são imunorreagidas com anticorpos contra PGP9.5 (sinal amarelo) para fibras nervosas cutâneas e CD31 (sinal verde) para células endoteliais dos vasos sanguíneos dérmicos. As setas indicam fibras nervosas que inervam os vasos sanguíneos. As setas brancas indicam seções com fibras nervosas dérmicas que se aproximam dos vasos sanguíneos. Barra de escala: 20 μm. Abreviações: FMS: síndrome da fibromialgia, PGP9.5: produto do gene da proteína-9.5.
(consulte no texto original imagens e tabelas)
Comprimento mediano das fibras nervosas peptidérgicas imunorreativas a anticorpos contra CGRP (FMS: epiderme 0,26 μm / μm, faixa de 0 a 0,61; controles: epiderme 0,28 μm / μm; faixa de 0,12 a 0,57; fig 3A) e SP (FMS: 0,03 μm / μm epiderme, faixa de 0 a 0,13; controles: 0,014 μm / μm de epiderme, faixa de 0 a 0,11; Fig 3B) não diferiram entre os grupos. O comprimento mediano das fibras nervosas mielinizadas positivas para NF200 foi semelhante entre os pacientes com SFM (epiderme de 0,34 μm / μm, intervalo de 0,075 a 0,75) e controles (epiderme de 0,37 μm / μm, intervalo de 0,15 a 0,55; n.s .; Fig. 3C).
Fig 3. Fibras positivas para CGRP, SP e NF200.
a: O comprimento das fibras nervosas dérmicas positivas para CGRP não diferiu entre pacientes e controles com SFM. b: O comprimento das fibras nervosas dérmicas positivas para SP não diferiu entre pacientes e controles com SFM. c: O comprimento das fibras nervosas dérmicas positivas para NF200 não diferiu entre pacientes e controles com SFM. Abreviações: CGRP: peptídeo relacionado ao gene da calcitonina; SFM: síndrome da fibromialgia; NF200: neurofilamento 200; SP: substância P.
(consulte no texto original imagens e tabelas)
Análise de subgrupos
Ao investigar amostras de pele de pacientes com SFM com IENFD normal e reduzida no bezerro, não encontramos diferença no DNFL. A quantificação da imunorreação CGRP, SP e NF200 também não mostrou diferenças intergrupos. Além disso, não encontramos correlações entre os dados clínicos e histológicos (dados não mostrados).
Discussão
Analisamos a inervação epidérmica e dérmica de pacientes com SFM em comparação com controles saudáveis para avaliar se uma possível alteração na composição das fibras nervosas que inervam a pele pode estar associada à dor na SFM. Encontramos um comprimento reduzido de fibras nervosas dérmicas em contato com vasos sanguíneos no grupo de pacientes com SFM em comparação com os controles, enquanto os subtipos de fibras nervosas dérmicas não mostraram diferenças intergrupos.
Até o momento, não há dados disponíveis que caracterizem subpopulações epidérmicas de pequenas fibras na pele humana devido à falta de imunorreatividade das fibras nervosas intra-epidérmicas a anticorpos direcionados contra antígenos que não sejam o PGP9.5. Dois estudos relataram poucas fibras nervosas peptidérgicas na epiderme de controles saudáveis [20,21]. A maioria dos estudos mostrou fibras nervosas peptidérgicas quase exclusivamente na derme [22,23]. Como relatado anteriormente [23], as fibras nervosas positivas para CGRP peptidérgicas estão tipicamente localizadas no plexo subepidérmico e apenas ocasionalmente entram na epiderme, enquanto as fibras positivas para SP são escassas e raramente penetram na epiderme.
Em contraste com as fibras epidérmicas, as fibras nervosas dérmicas podem ser visualizadas mais facilmente, permitindo a distinção entre diferentes subpopulações de fibras. Em pacientes com neuropatias pequenas de fibras, foi encontrada uma redução do DNFL, determinada pela imunorreação de amostras de biópsia por punção cutânea com PGP9.5 [18,24]. Nestes estudos, o DNFL também se correlacionou com o IENFD.
Em um estudo, a inervação de derivações arteríolas-vênulas da pele hipotenar foi avaliada em pacientes com SFM e controles saudáveis, revelando que pacientes com SFM apresentavam excessiva inervação peptidérgica [25]. Por outro lado, nosso estudo mostra uma redução da inervação dos vasos na pele obtida da parte inferior da perna. Essa discrepância pode ser devida ao local da biópsia em termos de localização (mão versus perna) e consistência da pele (glabra versus pele peluda). Além disso, o fato de termos avaliado todos os vasos dérmicos, independentemente dos subtipos, em contraste com as derivações arteríola-vênula em Albrecht et al. pode ter influenciado os resultados.
Não detectamos diferenças no comprimento das fibras nervosas de outros subtipos de fibras nervosas analisadas (PGP9.5, CGRP, SP, NF200), nem no grupo de pacientes como um todo, nem no subgrupo de pacientes com IENFD reduzido. Isso pode indicar que as alterações da inervação da pele na SFM são mais pronunciadas na camada epidérmica superficial do que na camada dérmica mais profunda.
Falhamos na investigação das fibras nervosas não peptidérgicas sem um anticorpo suficientemente específico contra os respectivos antígenos e, portanto, não podemos descartar a possibilidade de diferenças intergrupos. Não encontramos evidências de uma mudança na composição das subpopulações de fibras nervosas em nosso grupo de pacientes em comparação aos controles, mas fornecemos dicas para redução da inervação dérmica dos vasos sanguíneos. Além disso, ainda é possível que o padrão do canal iônico dos nociceptores seja alterado nos pacientes com SFM em comparação com os controles, no entanto, não pudemos testar essa hipótese, pois nenhum dos anticorpos do canal iônico utilizado exibia ligação específica às fibras nervosas da pele. Além disso, podemos apenas especular sobre possíveis correlatos funcionais de nossos dados, uma vez que não realizamos testes respectivos, como a investigação do reflexo do reflexo do axônio. No entanto, nossos dados estão de acordo com estudos anteriores, dando dicas para uma circulação periférica alterada em pacientes com SFM [26,27]. Nossos testes de laboratório foram limitados às principais causas de comprometimento de pequenas fibras. Investigamos o biomaterial a partir de apenas um local de biópsia no bezerro e não incluímos um segundo local na coxa devido à laboriosa avaliação histológica individual e manual. Não podemos especular sobre uma potencial influência do índice de massa corporal (IMC) em nossos resultados, pois não documentamos o IMC dos controles. Além disso, o tamanho da coorte de controle para a inervação dos vasos foi n = 15, pois algumas das manchas não puderam ser avaliadas devido a razões técnicas. Além disso, ainda não está claro se as fibras nervosas observadas nas proximidades do vaso sanguíneo dérmico inervam esses vasos. Portanto, a validação de dados em uma coorte maior e usando técnicas avançadas de microscopia é garantida. Especulamos que o número reduzido de fibras nervosas dérmicas que entram em contato com os vasos sanguíneos observados aqui pode levar a uma auto-regulação prejudicial dos vasos, resultando em baixa tolerância a temperaturas quentes e frias comumente relatadas por pacientes com SFM [28]. Nossos dados aumentam a crescente evidência de uma contribuição do sistema nervoso periférico e uma base estrutural da fisiopatologia da SFM. Mais pesquisas comparando pacientes com SFM com e sem redução da inervação dérmica dos vasos são necessárias para esclarecer o impacto funcional de nossos achados.
Informações de Apoio
Fotomicrografia ilustrando a avaliação do comprimento da fibra do nervo dérmico.
A área dérmica analisada a partir da borda dérmico-epidérmica media 150 μm de profundidade e 700 μm de comprimento. As fibras nervosas localizadas nas quatro áreas dérmicas marcadas foram rastreadas manualmente.
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S1 Fig. Fotomicrografia ilustrando a avaliação do comprimento da fibra do nervo dérmico.
A área dérmica analisada a partir da borda dérmico-epidérmica media 150 μm de profundidade e 700 μm de comprimento. As fibras nervosas localizadas nas quatro áreas dérmicas marcadas foram rastreadas manualmente.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227674.s001
(TIF)
Agradecimentos
Agradecemos a Daniela Urlaub e Kathleen Stahl pela excelente assistência técnica e a Christoph Erbacher, MSc. para obter ajuda com fotomicrografias.
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texto original
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0227674
