Abstrato
Embora evidências substanciais tenham estabelecido que microglia e astrócitos desempenham um papel fundamental no estabelecimento e manutenção de dor persistente em modelos animais, o papel das células gliais nos distúrbios da dor humana permanece desconhecido. Aqui, usando a nova tecnologia de tomografia por emissão de pósitrons integrada e ressonância magnética e o radioligando 11C-PBR28 recentemente desenvolvido, mostramos níveis cerebrais aumentados da proteína translocadora (TSPO), um marcador da ativação glial, em pacientes com dor lombar crônica . Como o polimorfismo Ala147Thr no gene TSPO afeta a afinidade de ligação para 11C-PBR28, nove pares de pacientes-controle foram identificados a partir de uma amostra maior de indivíduos examinados e genotipados, e comparados em um design de pares combinados, no qual cada paciente foi correspondido a Polimorfismo TSPO, sujeito controle pareado por idade e sexo (sete Ala / Ala e dois Ala / Thr, cinco homens e quatro mulheres em cada grupo; diferença média de idade: 1 ano; faixa etária: 29-63 para pacientes e 28- 65 para controles). Os valores padronizados de captação normalizados para o cérebro inteiro foram significativamente maiores em pacientes do que os controles em várias regiões do cérebro, incluindo o tálamo e as representações somatossensoriais putativas da coluna lombar e da perna. Os níveis talâmicos de TSPO foram negativamente correlacionados com a dor clínica e os níveis circulantes da citoquina pró-inflamatória interleucina-6, sugerindo que a expressão de TSPO exerce efeitos protetores / anti-inflamatórios da dor em humanos, como previsto em estudos com animais. Dado o papel putativo da glia ativada no estabelecimento e / ou manutenção da dor persistente, os presentes achados oferecem implicações clínicas que podem servir para orientar estudos futuros da fisiopatologia e do manejo de uma variedade de condições de dor persistente.
Introdução
Até recentemente, pensava-se que a dor crônica surgisse principalmente da disfunção neuronal nas vias nociceptivas do sistema nervoso (Hains e Waxman, 2006). Na última década, no entanto, ocorreu uma mudança de paradigma no campo da neurobiologia da dor. Estudos em animais demonstraram claramente que microglia e astrócitos no SNC, bem como interações neuro-gliais, desempenham um papel fundamental no estabelecimento e manutenção de dor persistente (Tsuda et al., 2003; Watkins et al., 2007; Calvo et. al., 2012; Ji et al., 2013). Tanto a micróglia quanto os astrócitos respondem a eventos patológicos no SNC, como acidentes vasculares cerebrais, traumas ou doenças neurodegenerativas, passando por uma série de respostas celulares conhecidas coletivamente como 'ativação glial' (Gehrmann et al., 1995; Pekny et al., 2014). Essa resposta inclui proliferação, alterações morfológicas, expressão aumentada ou de novo de marcadores ou receptores da superfície celular e a produção de citocinas e outros mediadores inflamatórios. Normalmente, a ativação glial é um mecanismo defensivo adaptativo que pode contribuir para lidar com o estresse agudo, limitar os danos nos tecidos e restaurar a homeostase. No entanto, quando o mau funcionamento (e, principalmente, quando não é resolvido durante o estágio crônico pós-agudo ou inicial após um evento de lesão) (Rolls et al., 2009), a ativação glial pode ter efeitos deletérios e se transformar no agente patogênico primário. elemento (Pekny e Pekna, 2014). Vários estudos em animais já estabeleceram que a ativação glial é um fator contribuinte essencial na dor persistente. Está bem demonstrado que microglia e astrócitos ativados podem produzir citocinas como fator de necrose tumoral alfa (TNFA) e interleucina 1 beta (IL1B), e acredita-se que essas citocinas desempenhem um papel essencial na patogênese da dor crônica (Watkins et al. , 2007; Uceyler e Sommer, 2012). Também foi demonstrado que o TNFA e o IL1B podem modular diretamente a transmissão sináptica da medula espinhal para induzir sensibilização central e melhorar os estados de dor (Kawasaki et al., 2008). Além disso, a injeção intraespinhal de glia ativada produz alodinia tátil, uma característica da dor neuropática, em ratos ingênuos (Tsuda et al., 2003). Por outro lado, a injeção de drogas que inibem a ativação glial pode inibir, retardar ou reverter a dor (Meller et al., 1994; Watkins et al., 1997; Guo et al., 2007; Okada-Ogawa et al., 2009). Essas observações, juntamente com outras evidências crescentes de modelos de laboratório, sugerem que a dor crônica pode resultar da gliopatia (Ji et al., 2013).
Em humanos, algumas observações sugerem que a glia ativada pode contribuir para a fisiopatologia da dor crônica. Por exemplo, estudos imuno-histoquímicos post mortem na medula espinhal de pacientes com síndrome da dor regional complexa (Del Valle et al., 2009) e dor neuropática relacionada ao HIV (Shi et al., 2012), bem como amostragem do LCR em pacientes com fibromialgia e lombalgia crônica (LBP) (Brisby et al., 1999; Kadetoff et al., 2012), apoiam um papel da glia na dor crônica. Apesar dessas observações, no entanto, nenhum estudo demonstrou ativação glial in vivo em humanos que sofrem de dor crônica. Clinicamente, o reconhecimento do papel da ativação glial nos distúrbios da dor é uma promessa significativa para a precisão diagnóstica aprimorada dos distúrbios da dor. Também pode fornecer uma base biológica para a avaliação dos tratamentos existentes e o desenvolvimento de novos.
Neste estudo, testamos a hipótese de que pacientes com dor crônica demonstram ativação in vivo da glia cerebral. Para avaliar esta hipótese, imaginamos o cérebro de indivíduos diagnosticados com dor lombar crônica e voluntários saudáveis sem dor, usando um scanner de tomografia por emissão de pósitrons integrado Siemens 3 T / ressonância magnética (PET / MRI) e o radioligando PET recentemente desenvolvido, 11C -PBR28 (Brown et al., 2007; Briard et al., 2008). O 11C-PBR28 se liga à proteína translocadora (18kDa) (TSPO), uma proteína regulada positivamente na microglia ativada e astrócitos reativos em modelos animais de dor (Hernstadt et al., 2009; Wei et al., 2013) e um biomarcador de imagem putativo de inflamação (Cagnin et al., 2007). Além disso, como as evidências sugerem que citocinas pró-inflamatórias são secretadas pelas células da glia em vários modelos animais de dor (Ji et al., 2013), avaliamos os níveis sanguíneos de interleucina 6 (IL6), IL1B e TNFA e avaliamos sua associação com a nossa. achados de imagem.
materiais e métodos
Design de estudo
O estudo foi realizado no Athinoula A. Martinos Center for Biomedical Imaging no Massachusetts General Hospital. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa e pelo Comitê de Pesquisa sobre Medicamentos Radioativos.
assuntos
Dezenove pacientes diagnosticados com dor lombar crônica por pelo menos 2 anos (com ou sem queixas de dor radicular) e 25 controles saudáveis sem histórico de dor crônica foram selecionados inicialmente para participar do estudo. Os indivíduos foram excluídos se apresentassem contra-indicações de PET / RM (incluindo gravidez, implantes metálicos, claustrofobia), apresentassem histórico de distúrbios médicos graves ou estivessem em uso de benzodiazepínicos ou anticoagulantes (consulte a Tabela Suplementar 1 para histórico de dor e informações demográficas).
O polimorfismo Ala147Thr no gene TSPO prediz afinidade de ligação para 11C-PBR28, com os genótipos Ala / Ala, Ala / Thr e Thr / Thr associados a alta, mista e baixa afinidade, respectivamente (Owen et al., 2012; Kreisl et al., 2013; Yoder et al., 2013). Assim, todos os participantes foram testados para esse polimorfismo e indivíduos com afinidade de baixa ligação prevista (Thr / Thr) foram excluídos. Dado o efeito do polimorfismo TSPO na afinidade de ligação ao 11C-PBR28 e o fato de que os efeitos do sexo e da idade na ligação do ligante são desconhecidos, foi adotado um design de pares combinados, no qual cada paciente era compatível com um polimorfismo TSPO- , controle pareado por idade e sexo. Dos 44 indivíduos selecionados inicialmente, nove pares crônicos de LBP / controle (com dois pacientes combinando o mesmo controle) foram identificados no pool inicial, consistindo em sete pares Ala / Ala e dois Ala / Thr e cinco pares masculino e quatro feminino , com média de diferença de idade de 1 ano (tabela complementar 1).
Visita de triagem
Todos os participantes considerados potencialmente elegíveis após uma triagem inicial por telefone foram recrutados para participar de uma consulta de caracterização e treinamento de duas horas. Nesta visita, foi coletado sangue venoso para que todos os participantes fossem genotipados para o polimorfismo Ala147Thr TSPO, e foi realizado um teste de urina para garantir que nenhum dos indivíduos usasse benzodiazepínicos ou usasse drogas ilegais. No final da visita, todos os participantes concluíram o Inventário de Depressão de Beck (Turner e Romano, 1984; Geisser et al., 1997) e a Escala de Ansiedade e Depressão do Hospital (Zigmond e Snaith, 1983). Além disso, os pacientes preencheram o questionário McGill Pain Questionnaire (MPQ), formato curto (Melzack, 1987).
Visita de imagem
Em uma data separada, os participantes elegíveis foram convidados a participar de uma visita de imagem. No início da visita, foi coletado sangue venoso para avaliar os níveis de citocinas pró-inflamatórias circulantes: IL6, IL1B e TNFA (Tabela Suplementar 2). Essas citocinas pró-inflamatórias específicas foram avaliadas porque são secretadas pelas células da glia em vários modelos animais de dor (Ji et al., 2013).
A imagem do cérebro foi realizada com um scanner Siemens PET / MRI (Catana et al., 2008) que consiste em um scanner PET baseado em fotodiodo de avalanche cerebral dedicado, operando no orifício de um scanner de ressonância magnética de corpo inteiro de 3 T equipado com um canal de 8 canais bobina de cabeça. O uso de PET / RM integrada nos permitiu coletar RM estrutural simultaneamente com os dados do PET. Os pacientes foram escaneados com 11C-PBR28, um radioligante TSPO recentemente desenvolvido que exibe uma ligação específica in vivo 80 vezes maior do que o radioligando TSPO TSC da geração anterior 11C- (R) -PK11195 (Kreisl et al., 2010). O 11C-PBR28 foi produzido internamente usando um procedimento modificado na literatura (Imaizumi et al., 2007).
No início da visita de imagem, realizamos uma série de exames de ressonância magnética, incluindo um volume MPRAGE de vários ecos (tempo de repetição / tempo de eco 1 / tempo de eco 2 / tempo de eco 3 / tempo de eco 3 / tempo de eco 4 = 2530 / 1,64 / 3,5 / 5,36 / 7,22 ms, ângulo de inversão = 7 °, tamanho do voxel = 1 mm isotrópico) para fins de localização anatômica, normalização espacial dos dados de imagem e geração de mapas de correção de atenuação (Izquierdo-Garcia et al., 2014) . O radioligando foi então injetado como um bolus intravenoso, com uma dose mediana administrada (intervalo interquartil) de 11,2 (0,3) mCi para pacientes com dor lombar crônica e 11,2 (0,6) mCi para controles e uma atividade mediana específica no momento da injeção de 2,7 (0,8) mCi / nmol para LBP crônica e 2,0 (1,2) mCi / nmol para controles (ambos os valores não são significativamente diferentes entre os grupos). Os dados PET foram adquiridos ao longo de 90 minutos para todos, exceto dois indivíduos (veja abaixo) e armazenados no formato de lista. Durante a visita de imagem, todos os sujeitos, exceto um, classificaram seu nível de dor usando uma escala de classificação numérica verbal de 0 a 100 (dor: 0 = 'sem dor', 100 = 'dor mais intensa tolerável'). O sujeito remanescente (um voluntário saudável) foi escaneado sob um protocolo separado, que não exigia classificações de dor antes e depois das execuções funcionais (mas era idêntico nos procedimentos e parâmetros da visita de imagem).
Análise de dados
Utilizando software interno, foram calculados valores de captação padronizados (SUV; isto é, radioatividade média / dose injetada / peso) para cada sujeito. Os SUVs foram usados anteriormente como uma medida da expressão de TSPO em humanos (Hirvonen et al., 2012; Fujita et al., 2013) e roedores (Shao et al., 2013). Os SUVs foram computados em voxel a partir dos dados de PET de 60 a 90 minutos após a injeção, exceto dois indivíduos (um paciente e um controle) para os quais os SUVs foram calculados de 72 a 89 minutos e 60 a 86 minutos, respectivamente, devido à indisponibilidade do quadro completo de 60 a 90 minutos. Os dois indivíduos que combinaram esses indivíduos com dados incompletos foram reconstruídos com início e duração de quadro idênticos para as análises de grupo, para garantir que as diferenças no esquema de enquadramento do PET não afetassem nossos resultados. Para maximizar a precisão na reconstrução, os SUVs foram gerados em um processo iterativo de duas etapas. Primeiro, uma imagem SUV preliminar foi criada para cada sujeito usando um mapa de correção de atenuação (mu-map) calculado a partir do MPRAGE em seu espaço nativo (Izquierdo-Garcia et al., 2014). Para levar em consideração o movimento que pode ter ocorrido entre o momento em que os dados PETRA do MPRAGE e os 60-90 min foram adquiridos, um novo mu-map foi criado a partir do MPRAGE registrado neste mapa SUV temporário. Esse registro foi realizado usando o spmregister, uma ferramenta do pacote FreeSurfer (http://surfer.nmr.mgh.harvard.edu) (Dale et al., 1999) que realiza um registro de corpo rígido de um volume funcional em relação a seu parente Volume anatômico do FreeSurfer com informações mútuas normalizadas usando spm_coreg da suíte SPM (http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/) (Friston, 2003). Um mapa SUV final foi criado usando esse novo mu-map, agora bem registrado com os dados PET de 60 a 90 minutos. Os mapas SUV foram então normalizados para o espaço MNI usando registro não linear (FNIRT, do pacote FSL; FMRIB's Software Library, versão 4.1.9, www.fmrib.ox.ac.uk/fsl/) (Smith et al., 2004 ) As imagens de SUV espacialmente normalizadas foram suavizadas espacialmente (largura total a metade do máximo = 8 mm) para melhorar a relação sinal / ruído e normalizadas por intensidade com uma média de 1 (SUVRs), a fim de explicar as diferenças globais de sinal entre sujeitos, como os introduzidos por diferenças no polimorfismo Ala147Thr, que afeta a afinidade de ligação global.
Embora os sujeitos digitalizados tenham sido cuidadosamente selecionados a partir de um tamanho de amostra maior para corresponder a fatores genéticos e demográficos, o tamanho da nossa amostra final foi relativamente pequeno. Por esse motivo, comparações de imagens e grupos comportamentais foram realizadas usando testes não paramétricos. Como a ativação da glia foi postulada para se espalhar transinapticamente a partir do local da lesão, seguindo as vias neurais lesionadas (Banati, 2003), hipotetizamos que em pacientes com ativação glial crônica da lombalgia seriam detectados nas regiões precoces do processamento da dor, pois são mais comuns. proximal aos locais patológicos nas costas (por exemplo, medula espinhal / raízes nervosas). Assim, uma análise da região de interesse direcionada ao tálamo foi realizada pela primeira vez para testar esta hipótese regionalmente específica. Nesta análise, foi realizado um teste de pares combinados (teste de sinal) nas SUVRs médias extraídas dos voxels nas etiquetas direita e esquerda do tálamo do Atlas Estrutural Subcortical de Harvard-Oxford (Centro de Análises Morfométricas, http: // www. cma.mgh.harvard.edu/fsl_atlas.html), com limite no valor arbitrário de 30.
Em seguida, realizamos uma análise do cérebro inteiro, em termos de voxel e pares pareados, com o objetivo de identificar (i) qual sub-região talâmica estaria impulsionando o efeito nas análises da região de interesse (se alguma foi detectada); e (ii) regiões adicionais de ativação glial dentro de todo o cérebro. Essa análise foi conduzida usando a ferramenta aleatória não paramétrica do conjunto FSL (Nichols e Holmes, 2002), com 10.000 permutações e suavização de variância de 5 mm (que aumenta a potência com tamanhos de amostra menores: http: //fsl.fmrib.ox .ac.uk / fsl / fslwiki / Randomise / UserGuide). Finalmente, como a exposição a opioides também pode levar a uma reação glial em si (Watkins et al., 2009), realizamos a mesma análise do grupo SUVR após a exclusão dos dados dos dois pacientes em uso de opioides (e seus controles correspondentes; sete versus sete) e limitamos nossa pesquisa a clusters significativos da análise original. Em todos os casos, os mapas de comparação de grupos de voxel em todo o cérebro foram limitados usando aprimoramento de cluster sem limiar (Smith e Nichols, 2009), usando um limiar corrigido de P = 0,05. Para as análises de região de interesse e voxel do cérebro inteiro, a comparação de nove pares de controle do paciente foi repetida (por uma questão de consistência) em duas análises separadas de pares combinados, cada uma usando um dos dois pacientes com o mesmo controle. Nas análises voxel, realizamos uma pesquisa no cérebro inteiro usando os dados do paciente que melhor correspondiam ao controle em termos de idade; subsequentemente, as análises em voxel foram repetidas usando os dados do outro paciente, limitando nossa pesquisa a grupos significativos da primeira análise.
A comparação do grupo de dados comportamentais e sanguíneos foi realizada usando o teste de sinal não paramétrico ou, quando aplicável, o teste exato de Fisher. Essas análises foram realizadas usando o Statistica v.10 (StatSoft). Para a avaliação exploratória da relação entre imagem e medidas comportamentais / sanguíneas, foi necessário avaliar a associação entre imagem e parâmetros clínicos, ajustando-se ao polimorfismo de TSPO. Fizemos isso usando análise de regressão múltipla. Para ser consistente em nosso uso de métodos não paramétricos, usamos um método de regressão não paramétrico, Modelos Aditivos Generalizados. Para exibir a relação entre variáveis em gráficos de dispersão, calculamos os resíduos ajustando para o efeito do genótipo. Realizamos essas análises usando a biblioteca gam no pacote de estatísticas R (http://www.R-project.org). A significância estatística foi determinada pelo limiar de P = 0,05.
Resultados
Níveis mais altos de TSPO no cérebro em pacientes com dor lombar crônica
Na análise da região talâmica de interesse, os SUVs 11C-PBR28, normalizados para o cérebro inteiro, (SUVRs) foram significativamente maiores em pacientes com dor lombar crônica do que os controles (tálamo esquerdo: P ≤ 0,01; tálamo direito: P ≤ 0,05; fig. 1A) . A distribuição em voxel dos SUVRs talâmicos (Fig. 1B) revelou que, nos indivíduos controle, a contagem média zero de voxel foi observada apenas abaixo dos valores de 1,4, enquanto que em pacientes com dor lombar crônica, um número substancial de voxels demonstrou valores superiores a 1,4 em ambos. hemisférios (medianas: 57,5 e 64 no tálamo esquerdo e direito, respectivamente).
Figura 1
Evidências de ativação glial no tálamo de pacientes com dor lombar crônica. (A) Boxplots são apresentados para os SUVRs 11C-PBR28 médios extraídos para todos os 10 pacientes com dor lombar crônica e nove indivíduos controle das regiões talâmicas de interesse (inserção). Os valores P referem-se a análises de pares combinados (teste de sinal) realizadas usando nove pares correspondentes crônicos de controle de dor lombar. As análises foram repetidas duas vezes, cada vez usando um dos dois pacientes combinando o mesmo controle, com resultados estatisticamente significativos em ambas as análises. * P<0 0.="" 1="" 3d="" ala="" ao="" apresentados="" axiais="" cada="" com="" como="" contagem="" controle="" controles="" correspondente="" cr="" de="" direita="" distribui="" do="" dor="" e="" em="" enquanto="" es="" esquerda="" exibe="" font="" indicado.="" individuais="" la="" limite="" linha="" lombar="" m="" maiores="" mediana="" mero="" micos="" mostrando="" n="" nica="" o="" os="" ou="" p="" paciente.="" pacientes="" par="" para="" polimorfismo="" que="" renderiza="" s="" se="" setas="" substancial="" suvrs="" t="" tal="" thr="" tspo="" um="" uma="" valores="" verdes="" voxel="" voxels="">
O exame de SUVRs talâmicos individuais (Fig. 1C) mostra que, surpreendentemente, cada paciente exibia SUVRs mais altos do que seu controle de idade / sexo e genótipo TSPO no tálamo. Em todos os pacientes, as áreas com níveis máximos de TSPO foram localizadas consistentemente nas sub-regiões dorsomediais do tálamo, conforme ilustrado pela renderização em 3D (Fig. 1C).
Nas análises de voxel do cérebro inteiro, os SUVRs foram significativamente mais altos no tálamo, giros pré e pós-central e lóbulo paracentral (Fig. 2 e Tabela Suplementar 3). A diferença do grupo de pico foi observada no tálamo esquerdo, consistente com o núcleo mediodorsal. Não houve regiões cerebrais para as quais os controles saudáveis apresentaram SUVRs estatisticamente maiores que os pacientes com dor lombar crônica. Quando examinadas no limiar exploratório de P<0 1="" 2009="" 4="" a="" abela="" adicionais="" al.="" al="" altas="" assim="" atkins="" base.="" c="" cingulado="" compara="" complementar="" confundidos="" controles="" correspondentes="" corrigido="" cr="" da="" de="" demonstraram="" dio="" disso="" do="" dois="" dor="" dos="" e="" em="" enquanto="" es="" et="" exclus="" exposi="" font="" frontal="" g="" glial="" ig.="" incluindo="" ingest="" levar="" lombar="" ltiplas="" m="" mais="" motora="" n="" na="" nglios="" nica="" nossos="" nsula="" o="" opioides.="" opioides="" os="" pacientes="" para="" parecem="" pela="" pode="" posterior="" pr="" produziu="" que="" rea="" regi="" resultados="" rtex="" semelhantes="" ser="" seus="" suplementar="" suvrs="" tamb="" uma="" uso="" ventromedial="">
Figura 2
Análises de voxel em todo o cérebro. (A) Mapa mediano da SUVR de controles saudáveis (n = 9) e pacientes com dor lombar crônica (n = 10) são apresentados. Os testes de pares combinados (nove versus nove) revelaram níveis significativamente mais altos de TSPO em pacientes, no tálamo, giros pré e pós-central e lóbulo paracentral (P<0 10.000="" a="" agrupamentos="" altos="" an="" ao="" as="" boxplots="" busca="" cada="" com="" combinando="" como="" compara="" controle.="" controles="" correspondia="" corrigido="" da="" das="" de="" demonstrando="" dois="" em="" es="" estatisticamente="" estavam="" fins="" foi="" foram="" g.="giro;" id="" ilustrativos.="" limitando="" lise="" lises="" lob.="lóbulo" ltiplas="" m="" mais="" melhor="" mesmos="" mostrados="" nossa="" nticos.="" o="" os="" outro="" p="" paciente="" pacientes="" para="" parac.="" partir="" permuta="" postc.="pós-central;" prec.="precentral.</div" primeira="" primeiro="" quatro="" que="" realizada="" realizadas="" regi="" resultados="" s-central="" s="" segunda="" significativos="" suvrs="" teste="" uma="" usando="">
Expressão TSPO como um mecanismo de proteção?
Nos pacientes, as métricas de imagem 11C-PBR28, corrigidas para o genótipo, foram negativamente associadas às medidas de resultado da dor (Fig. 3A – C) e aos níveis circulantes de IL6 (Fig. 3D). Primeiro, o número de voxels talâmicos com valor SUVR> 1,4 foi associado negativamente aos níveis de dor no momento da varredura e à pontuação total no McGill Pain Questionnaire (P <0 de="" il6="" mas="" n="" nos="" o="" ou="" tnfa="" valores-p="" veis="">0,3). Segundo, as SUVRs médias extraídas do cluster talâmico estatisticamente significantes na análise voxel foram negativamente associadas aos níveis de IL6 (P<0 0="" a="" abaixo="" alcan="" aos="" associa="" avaliada.="" com="" dados="" de="" detec="" div="" do="" dor="" duos="" durante="" e="" em="" entre="" escores="" essa="" estat="" estavam="" exame="" foi="" il1b="" imagem="" indiv="" limiar="" m="" mas="" mcgill="" mico="" n="" ncia="" negativa="" o="" observada="" os="" ou="" p="" pain="" pbr28="" portanto="" questionnaire="" ser="" signific="" stica="" suvr="" tal="" tnfa="" todos="" totais="" trica="" veis="">
Figura 3
Papel anti-inflamatório e anti-nociceptivo do TSPO. SUVRs foram associados negativamente com os resultados da dor (A-C) e os níveis sanguíneos de interleucina-6 (D). Os gráficos de dispersão mostram os resíduos ajustados para o efeito do genótipo. MPQ = McGill Pain Questionnaire.
Discussão
Nosso estudo demonstra a ocorrência de ativação glial, medida pelo aumento da ligação 11C-PBR28, no cérebro de pacientes com dor crônica. O aumento da ligação do marcador foi observado com maior destaque no tálamo e com notável consistência entre os sujeitos (Fig. 1C).
Dentro dos córtices somatossensorial e motor primário (S1 / M1), os SUVRs eram mais altos nas representações sensório-motoras putativas da coluna lombar [no giro pós-central; Boendermaker et al. (2014) e perna (no lóbulo paracentral); Loggia et al. (2012)]. Esse padrão espacial é consistente com a maioria dos pacientes que sofrem de dor na região lombar e na (s) perna (s), e é sugestivo de ativação glial organizada somatotopicamente em S1 / M1 (que por sua vez também é consistente com a observação de que a ativação glial espinhal geralmente segue limites somatotópicos após lesão nervosa poupada unilateral em ratos) (Beggs e Salter, 2007).
Na última década, pesquisas com animais levaram ao aumento do reconhecimento da importância das células gliais (como microglia e astrócitos) e sua interação com células neuronais, na patogênese das condições de dor (Tsuda et al., 2003; Watkins et al. al., 2007; Calvo et al., 2012; Ji et al., 2013). Por exemplo, a lesão nervosa induz uma ativação e proliferação profundas da microglia espinhal (Liu et al., 2000; Beggs e Salter, 2007; Echeverry et al., 2008; Beggs et al., 2012; Calvo e Bennett, 2012) e a a regulação positiva de uma variedade de receptores nessas células, como o receptor P2RX4 de adenosina trifosfato (ATP) (também conhecido como P2X4) (Tsuda et al., 2003) e o receptor de quimiocina CX3CR1 (Verge et al., 2004), que induzem hiperalgesia. As células microgliais ativadas produzem mediadores inflamatórios, incluindo citocinas pró-inflamatórias e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF; Coull et al., 2005; Ji e Suter, 2007) que ativam ou sensibilizam neurônios nociceptivos. A injeção intratecal de microglia ativada produz alodinia tátil em ratos ingênuos, sugerindo que a ativação microglial é suficiente para induzir a sensibilização à dor (Tsuda et al., 2003). Finalmente, a inibição farmacológica da ativação microglial impede ou atrasa a dor neuropática (Raghavendra et al., 2003; Ledeboer et al., 2005). Semelhante à microglia, os astrócitos têm demonstrado um papel na indução e manutenção da sensibilização à dor (Ji et al., 2006; Ren e Dubner, 2010; Ji et al., 2013). Por exemplo, em modelos trigêmeos de hiperalgesia inflamatória (Guo et al., 2007) ou após lesão do nervo trigêmeo (Okada-Ogawa et al., 2009), os astrócitos exibem hipertrofia e expressam enzimas, como a óxido nítrico sintase (Meller et al. ., 1994), bem como mediadores inflamatórios, como a citocina pró-inflamatória IL1B (Guo et al., 2007) e quimiocinas como CXCL2 (Chen et al., 2014), que contribuem para hiperalgesia e alodinia. A hiperalgesia térmica e mecânica é inibida ou atenuada pela injeção de agentes que interrompem a função astroglial (como fluorocitrato, um inibidor metabólico da glia) (Meller et al., 1994; Watkins et al., 1997; Gukins et al., 2007; Okada-Ogawa et al., 2009) ou a ação de produtos gliais (como antagonistas dos receptores de IL1) (Watkins et al., 1997). Tomados em conjunto, esses estudos demonstram que a microglia e os astrócitos desempenham um papel importante na patogênese da dor persistente em animais.
Embora uma infinidade de estudos em animais tenha demonstrado que as células da glia estão envolvidas no estabelecimento e manutenção de dor persistente, nenhum estudo demonstrou anteriormente a ativação da glia in vivo em humanos que sofrem de dor crônica. Nossas observações têm várias implicações potenciais. Em primeiro lugar, eles fornecem uma justificativa para explorar o papel da glia como alvo terapêutico para a dor crônica. Em animais, verificou-se que drogas que reduzem a ativação glial (por exemplo, propentofilina e minociclina) inibem potentemente citocinas pró-inflamatórias, suprimindo assim o desenvolvimento de dor neuropática (Mika, 2008; Leblanc et al., 2011). É importante ressaltar que algumas dessas moléculas já são aprovadas pelo FDA para tratar condições humanas de diferentes etiologias e, portanto, seria imediatamente possível testar novas indicações crônicas relacionadas à dor. Dois ensaios clínicos recentes (8 e 12 semanas de duração, respectivamente) indicaram que baixas doses de naltrexona (LDN) podem ter um impacto clinicamente benéfico na dor da fibromialgia (Younger e Mackey, 2009; Younger et al., 2013). Como se pensa que o LDN produz efeitos anti-inflamatórios principalmente por antagonizar a atividade das células da glia (Mattioli et al., 2010), esses estudos sugerem que os moduladores da glia podem ser benéficos para a fibromialgia e talvez outros subgrupos de pacientes com dor crônica. Por outro lado, deve-se notar que alguns ensaios clínicos tiveram resultados negativos. Um estudo clínico recente que avaliou a eficácia da propentofilina na redução da dor na neuralgia pós-herpética foi negativo (Landry et al., 2012). Outro estudo sugeriu que a administração peri-operatória de minociclina não melhorou a dor persistente após a discectomia lombar (Martinez et al., 2013). No entanto, preocupações metodológicas com esses estudos (Watkins et al., 2012) limitam a significância desses resultados negativos do estudo. Em particular, a duração do desenho do estudo foi extraordinariamente curta nos dois estudos. No primeiro estudo, a propentofilina foi administrada por 4 semanas e, no último, a minociclina foi administrada no período perioperatório por apenas 8 dias, em ambos os casos uma duração significativamente menor do que 12 semanas, como é mais comumente adotado em ensaios clínicos. Além disso, como os estudos demonstraram que é mais fácil prevenir do que a dor neuropática reversa usando moduladores da glia (Raghavendra et al., 2003), podem ser necessárias durações mais longas para alcançar a eficácia terapêutica (Watkins et al., 2012). Outros fatores também podem contribuir para explicar os resultados negativos nesses estudos, incluindo a dosagem e a possível interação com outros medicamentos ou a ingestão de alimentos (que pode não permitir que o medicamento chegue aos locais do SNC em níveis significativos) ou a escolha da população de pacientes (particularmente para o estudo propentofylline, como a evidência pré-clínica em apoio a um papel da glia na neuralgia pós-herpética é mais tênue do que em outras condições de dor crônica) (Watkins et al., 2012).
A possibilidade de visualizar a ativação glial relacionada à dor in vivo, que documentamos no presente estudo, pode ajudar a identificar os pacientes com maior probabilidade de se beneficiar dessa abordagem terapêutica e a identificar a duração ou dosagem ideal do tratamento. Dado o papel putativo da glia ativada em muitas questões desafiadoras associadas ao tratamento da dor, como a indução de hiperalgesia e tolerância induzidas por opióides (Eidson e Murphy, 2013; Ferrini et al., 2013), os presentes achados oferecem implicações clínicas que podem servem para orientar futuros estudos sobre a fisiopatologia e o manejo de uma variedade de condições persistentes de dor.
Neste estudo, a ativação glial foi avaliada usando os níveis cerebrais de TSPO, anteriormente chamado receptor periférico de benzodiazepina (Banati et al., 1997; Papadopoulos et al., 2006). Como modelos experimentais de animais e estudos humanos post-mortem de distúrbios do SNC mostraram de maneira confiável aumentos concomitantes e co-localizados na expressão de TSPO e marcadores para astrócitos ativados e / ou micróglia, a expressão de TSPO é amplamente reconhecida como um marcador da ativação glial na lesão do SNC e doença. Por exemplo, a co-localização da ativação glial e da regulação positiva do TSPO foi observada em modelos de roedores de encefalomielite autoimune experimental, em modelos de roedores de esclerose múltipla, bem como em lesões de esclerose múltipla humana (Vowinckel et al., 1997; Banati et al., 2000; Chen et al., 2004; Chen e Guilarte, 2006; Ji et al., 2008; Cosenza-Nashat et al., 2009; Abourbeh et al., 2012), em modelos de primatas não humanos da encefalite por HIV (Venneti et al., 2007; Cosenza-Nashat et al., 2009), bem como na encefalite por HIV humana (Cosenza-Nashat et al., 2009), tanto em modelos de isquemia post-mortem quanto em roedores experimentais de isquemia humana (Rojas et al. ., 2007; Cosenza-Nashat et al., 2009; Martin et al., 2010) e doença de Alzheimer (Ji et al., 2008; Cosenza-Nashat et al., 2009; Gulyas et al., 2009) e em modelos de roedores de neurotoxicidade por etanol e trimetil (Kuhlmann e Guilarte, 2000; Maeda et al., 2007). Mais pertinente ao nosso estudo, a TSPO foi regulada positivamente em astrócitos espinhais e microglia na monoartrite induzida por Adjuvante Completo de Freund (CFA) da articulação tíbio-tarso (Hernstadt et al., 2009) e após dor na ligadura do nervo espinhal L5 (Wei et al. , 2013). Diante dessas observações, o aumento dos níveis de 11C-PBR28 que observamos em pacientes com dor crônica pode ser interpretado como evidência de ativação glial. Curiosamente, o envolvimento dos subtipos gliais nas respostas neuroinflamatórias parece depender do curso da doença. Em vários modelos animais, a regulação positiva inicial de TSPO após insulto agudo no SNC é acompanhada por uma resposta predominantemente microglial que tipicamente atinge o pico e começa a se dissipar vários dias a semanas após a lesão. Essa resposta microglial rápida é paralela a um componente astrocítico atrasado, mas em constante aumento (Kuhlmann e Guilarte, 2000; Chen et al., 2004; Chen e Guilarte, 2006; Martin et al., 2010; Liu et al., 2014). Dados post-mortem em humanos parecem corroborar essa contribuição glial dependente de fase: nas lesões agudas da esclerose múltipla, micróglia e macrófagos representam a maioria das células TSPO +, enquanto os astrócitos são as células TSPO + dominantes em lesões silenciosas crônicas (Cosenza-Nashat et al., 2009 ) Como nossos pacientes sofreram anos de dor, é plausível que os astrócitos tenham contribuído significativamente para o aumento do sinal PET observado em nossos dados.
Embora o TSPO seja um marcador da glia ativada, um fenômeno considerado responsável pela amplificação dos sinais de dor no SNC (Ji et al., 2013), a própria expressão do TSPO foi demonstrada em animais por exercer efeitos inibitórios na neuroinflamação (Wei et al., 2013; Bae et al., 2014; Wang et al., 2014) e promover a recuperação da dor neuropática (Wei et al., 2013), provavelmente através da estimulação da esteroidogênese (Batarseh e Papadopoulos, 2010; Wei et al., 2013). De fato, estudos sugerem que uma das funções do TSPO na glia ativada é limitar a magnitude das respostas inflamatórias após o início (Wang et al., 2014). Nossa observação de que os SUVRs 11C-PBR28 se correlacionam negativamente com os níveis da citocina pró-inflamatória circulante IL6 e a dor corrobora ainda mais a hipótese de que a expressão de TSPO tem efeitos anti-inflamatórios e protetores da dor. As correlações negativas encontradas em nosso estudo, portanto, sustentam a alegação de que os ligantes de TSPO podem ser um novo alvo terapêutico para o tratamento da dor patológica (Wei et al., 2013), conforme sugerido anteriormente para uma variedade de condições (Rupprecht et al., 2009 , 2010). Como a expressão de TSPO é regulada positivamente na glia ativada e foi encontrada uma correlação negativa com citocinas periféricas e dor em nosso estudo, baixos níveis de TSPO podem ser interpretados de maneira diferente entre os grupos. Por exemplo, em voluntários saudáveis, baixos níveis poderiam simplesmente refletir baixos níveis de ativação glial. Por outro lado, pacientes com dor crônica exibindo níveis mais baixos de TSPO podem ter prejuízos na expressão de TSPO na glia ativada e, portanto, na capacidade de limitar as respostas gliais após o início. Claramente, são necessários estudos adicionais para elucidar a relação entre 11C-PBR28 e marcadores periféricos de inflamação, particularmente porque os níveis de citocinas periféricas são frequentemente dissociados dos do SNC (Bromander et al., 2012).
Estudos futuros, incluindo alguns atualmente em andamento em nosso laboratório, precisarão determinar se diferentes populações de dor apresentam diferenças na distribuição espacial da ativação glial. A descoberta de 'assinaturas gliais' de estados de dor crônica pode levar à identificação de marcadores de imagem objetivos que podem (i) complementar a avaliação subjetiva do paciente e outras medidas (por exemplo, testes sensoriais quantitativos) para orientar a prática clínica; e (ii) reduzir a heterogeneidade do paciente, que tradicionalmente leva a más relações sinal / ruído na maioria dos estudos clínicos de avaliação de medicamentos (Gomez-Mancilla et al., 2005). Finalmente, como as células da glia respondem a mudanças muito sutis em seu microambiente que precedem alterações patológicas detectáveis histologicamente (de Vries et al., 2006; Cagnin et al., 2007), a ativação glial pode ser um marcador precoce das alterações que demonstrou ocorrer no cérebro de pacientes com dor crônica (Tracey e Bushnell, 2009). Isso pode permitir a identificação precoce de indivíduos com risco de transição da dor aguda para a crônica, otimizando assim as estratégias de tratamento.
Em suma, nossos resultados demonstram um papel da glia nos distúrbios da dor humana, apoiam o papel da avaliação da ativação glial e da expressão de TSPO em áreas cerebrais seletivas como um marcador de imagem e potencial alvo de tratamento para distúrbios da dor crônica em humanos.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer a Patricia McCarthy, Nancy Shearer e ao Centro de Pesquisa Clínica do Hospital Geral de Massachusetts por fornecerem suporte de enfermagem, Drs Douglas Greve, Marc Normandin, Nicolas Guehl e Jean Logan pela ajuda no processamento de dados, Dra. Julie Price por comentários úteis, Dra. Nazem Atassi, por compartilhar os recursos de imagem, os drs. Randy Gollub e Alexander Guimaraes, pela ajuda na obtenção do consentimento informado, a Sra. Jiaxuan (Jessie) Wang, pelo apoio à logística do estudo, e a Sra. Ekaterina Protsenko, pela assistência editorial.
Financiamento
Este projeto foi apoiado pelo Harvard Catalyst Advanced Imaging Pilot Grant (JMH), 1R21NS087472-01A1 (MLL) 1UL1TR001102-01, 8UL1TR000170-05, do Centro Nacional de Ciência Translacional e 1UL1RR025758-04 do National Center for Research Resources, Harvard Clinical and Translational Science Center, e contribuições financeiras da Universidade de Harvard e de seus centros de saúde acadêmicos afiliados. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Harvard Catalyst, da Harvard University e de seus centros de saúde acadêmicos afiliados ou do National Institutes of Health. Os autores não têm conflitos de interesse ou interesses financeiros concorrentes a declarar.
